Култивиране на вируси в пилешки ембриони. Пилешки ембрион Начини за заразяване на пилешки ембрион с вирус
пилешки ембрион пилешки ембрион
(CE) - пилешки ембрион на различни етапи от ембрионалното развитие. В микробиол. практиката се използва за изолиране, култивиране и идентифициране на вируси, рикетсии и понякога бактерии. За лабораторни цели се избират пресни, наторени, с добре прозрачни и без пукнатини EC черупки. Инкубацията се извършва в гнездата на статив с тъп край на яйцето нагоре в добре вентилирани инкубатори или термостати при 37-37,5 ° C, относителна влажност 63-65%. За инфекция се избират 4-13-дневни ембриони с изразени кръвоносни съдове, жълтъчна торбичка и подвижна сянка. Преди заразяване черупките на яйцата се третират със спирт, изгарят се и в областта на инжектиране (често над въздушната камера) се намазват с 2% йодна тинктура. Материал или изследване. to-ru се въвежда, отваряйки или не отваряйки черупката, в жълтъчната торбичка (рикетсия), в алантоичните или амниотичните кухини (повечето вируси), прилага се върху хорион-алантоичната мембрана. По-рядко to-ru се инжектира в тялото на ембриона или интравенозно. Заразените ЕК се поставят в термостат при условия и за периоди, които зависят от вида на микроба и целите на изследването. Някои данни за резултатите от инфекцията могат да бъдат получени чрез външно изследване на ЕК под микроскоп (инжектиране на съд, загуба на подвижност и др.). В повечето случаи обаче CE се отваря. За да направите това, след третиране с алкохол и йодна тинктура, черупката се отрязва над границата на въздушната торбичка, алантоичната и след това амниотичната течност се изсмуква с пастьорова пипета или спринцовка, като се избягва увреждане на съдовете и жълтъка сак. Ембрионът и хорионалантоисната мембрана се отстраняват от черупката, поставят се в стерилни чаши, промиват се със стерилен дестилат. вода и преглед. По-нататъшният ход на изследването на ембриона и неговите течности зависи от вида на микроба или вируса и от целите на експеримента.
(Източник: Речник на термините по микробиология)
Вижте какво е "пилешки ембрион" в други речници:
ЕМБРИОТОКСИЧНОСТ- ембриотоксичност, способността на физически, биологични, химични и други агенти да оказват отрицателно въздействие върху развиващия се ембрион. Ембриотоксичният ефект на различни вещества се установява чрез излагане на жени ... ... Ветеринарен енциклопедичен речник
"Пилета" пренасочва тук; вижте и други значения. ? Домашно пиле ... Уикипедия
Пилета Пилетата са украса на всеки двор Научна класификация Царство: Животни Тип: Хордови Клас ... Уикипедия
След откритието, че грипните вируси се възпроизвеждат в пилешки ембриони, този метод е широко използван във вирусологията, тъй като е лесен за използване и евтин.
Използвайте пилешки ембриони на 7-9 дни (пълен цикъл на развитие 21 дни).
Преди инфекция повърхността се третира с алкохол, йоден разтвор, прави се дупка в черупката и се заразява със стерилна спринцовка.
Начини на инфекция: в амниотичната кухина, в алантоичната кухина или в жълтъчната торбичка. Вирусите се размножават върху съответните мембрани, натрупват се в течността на кухината, която след това може да бъде събрана за по-нататъшни изследвания.
Ембрионите се култивират при 37°C. 3 дни, след което черупката се обработва отново, ембрионът се отваря със стерилни инструменти и се събира съдържащата вирус течност. Цялата работа по инфекцията и аутопсията се извършва в кутията.
Култивиране върху клетъчни култури.
Клетъчните култури се използват във вирусологията през последните десетилетия, което направи възможно култивирането и изследването на много по-широк кръг от вируси, тъй като не всички човешки вируси могат да бъдат изолирани в животни или ембриони. По този начин съвременната вирусология използва клетъчни култури, от които в момента има огромен брой.
Разновидности на клетъчни култури
а) първиченполучен от ембрионална тъкан, чрез смилането й, третирането й с трипсин за дезагрегация (отделяне) на клетките и по-нататъшно култивиране
in vitro в специална културална течност.
б) трансплантирани- получени от туморна тъкан, те се различават по това, че могат да се култивират за неопределено време, като се сменят само хранителната среда и приборите.
По време на култивирането се получава монослой върху стъкло. : тоест един слой клетки.
Сега е възможно тези клетки да се заразят с тестовия материал със съмнения за вирус или с вече съществуващи вируси. Ястията с клетки, заразени и неинфектирани, се култивират в термостат при 37 градуса.
Процесът на натрупване на вириони в клетъчната култура продължава приблизително 48 - 72 часа.
С подходящи култури могат да бъдат култивирани практически всички човешки вируси.
Следващият етап на изследване е индикацията и идентифицирането на вирусите.
Методи за показване.
Индикация -това е откриване на вируси директно в тестовия материал или в културалната течност или в заразените клетки.
I. Ако вирионите са в течността, тогава те могат да бъдат открити с помощта на реакцията на хемаглутинация.
Същността на реакцията: някои видове вируси са в състояние спонтанно да се слепят (тоест да предизвикат хемаглутинация) на всякакви червени кръвни клетки. Например, грипните вириони лепят пилешки еритроцити, някои аденовируси лепят еритроцити от плъхове и т.н.
По този начин, използвайки суспензия от еритроцити във физиологичен разтвор, е възможно да се открият вируси в течност, съдържаща вирус.
II.Ако вирусите се размножават в клетъчна култура, но хемаглутинират, тогава те могат да бъдат открити с помощта на реакция на хемадсорбция: суспензия от червени кръвни клетки се прилага върху културата, инкубира се, изцежда се - ако културата е заразена, тогава червените кръвни клетки ще прилепете директно към заразените клетки - това може да се види в светлинен микроскоп.
III Други ефекти:
а) вирусите причиняват разрушаване на монослоя - това се нарича цитопатогенен ефект на вируса - CPE.
б) вирусите причиняват морфологични промени в клетките: вътреклетъчни или вътреядрени включвания, образуване на синцитий, симпласти (тоест сливане на няколко клетки в една формация поради увреждане на клетъчните мембрани).
Повечето от известните вируси имат способността да се размножават в пилешкия ембрион (фиг. 4). Ембрионите се използват на възраст от 8 до 14 дни, в зависимост от вида на вируса, метода на заразяване и целите на изследването. Грипните вируси се култивират на 9-10, ваксините срещу едра шарка - на 12, паротит - в 7-дневни пилешки ембриони. Възпроизвеждането на вируса в пилешки ембриони се случва в различни части на ембриона, което е свързано с особеностите на тропизма на вируса. Методът за отглеждане на вируса в пилешки ембрион се използва широко в промишленото отглеждане.
Структурата на пилешкия ембрион и методи на заразяване: 1 - в амниона; 2 - в алантоисната кухина; 3 - в жълтъчната торбичка. (Микробиология и имунология. Под редакцията на Vorobyov A.A. - M. - 1999).
Най-външната екстраембрионална мембрана, съседна на черупката или майчините тъкани и следователно служи като място за обмен между ембриона и неговата среда, се нарича хорион.При видовете, които снасят яйца, основната функция на хориона е осъществяването на респираторен газообмен. При бозайниците хорионът участва в дишането и храненето, отделянето, филтрирането и синтеза на вещества. При примитивните организми хорионът е вторичната мембрана, докато при напредналите организми е мембраната на плода. Кухината между хориона и амниона е хорионамниотична.
Амнион(гръцки Amnion), околоплоден мехур или Водна мембрана – една от ембрионалните мембрани в ембрионите на влечуги, птици, бозайници.
Еволюционно амнионът възниква, за да предпази ембрионите от изсъхване по време на развитие извън водната среда. Следователно гръбначните животни, които снасят яйца (влечуги и птици), както и бозайниците, произлезли от влечугите, се класифицират като амниоти („Животни с яйчени черупки“). Предходните класове и надкласове гръбначни животни (главохордови, циклостоми, риби, земноводни) снасят яйцата си във водна среда, така че не се нуждаят от водна черупка. Тези класове животни са обединени в група анамнии. За разлика от анамнията, амниотите не изискват водна среда за размножаване и ранно развитие, така че амниотите не са обвързани с водни тела. Това е еволюционната роля на амниона.
По време на раждането на бозайници водната черупка се спуква, водата изтича, а остатъците от амниона по тялото на новородено често се наричат „риза“, която от древни времена е знак за късмет и други суеверия ( оттук, по-специално, руската поговорка за тези, които са „родени в риза“).
Алантоис (от гръцки allantoeid?s - наденица) - ембрионалният дихателен орган на висшите гръбначни животни; зародишната мембрана, която се развива от задното черво на ембриона. Освен това алантоисът участва в газообмена на ембриона с околната среда и отделянето на течни отпадъци. Алантоисът, заедно с други ембрионални мембрани - амнион и хорион, е определящ признак на висшите гръбначни животни - бозайници, птици и влечуги.
При яйценосните птици и влечугите алантоисът се развива около ембриона по стените на черупката. Във външния си слой, наречен мезодерма, той създава обширна мрежа от кръвоносни съдове, чрез които взаимодейства с външната среда. При бозайниците алантоисът е част от пъпната връв.
Има няколко начина за заразяване на развиващ се пилешки ембрион: на хорионалантоичната мембрана, в алантоичната и амниотичната кухини, в жълтъчната торбичка и в тялото на ембриона.
Инфекцията върху хорионалантоисната мембрана се използва за изолиране и култивиране на вируси, които образуват плаки върху мембраните (вируси на ваксина, едра шарка, херпес симплекс). Преди заразяване яйцата са полупрозрачни с овоскоп, границата на въздушното пространство и хориоалантоисната мембрана се очертава с молив. Повърхността на яйцето над въздушното пространство и на мястото на инфекцията се избърсва със спирт, изгаря се, третира се с йод и се прави дупка в кухината на въздушната торбичка.
На мястото на инфекцията черупката се отстранява, за да не се повреди мембраната на черупката, която след това се пробива с къса стерилна игла, за да не се увреди хорионалантоисната мембрана. Въздухът от кухината на въздушната възглавница се изсмуква. Вирусният материал (0,05 - 0,2 ml) се нанася върху хорионалалантоисната мембрана с туберкулинова спринцовка с къса игла или пипета на Пастьор. Отворът в черупката се затваря със стерилно покривно стъкло или същото изрязано парче черупка и се запълва с разтопен парафин по ръбовете. Заразените ембриони се поставят хоризонтално върху стойка и се инкубират в термостат. Ембрионите се отварят не по-рано от 48 часа инкубация. Върху заразената черупка се откриват белезникави непрозрачни петна с различна форма (плаки).
Инфекция в алантоисната кухина. Вирусът, въведен в алантоиса, се размножава в ендодермалните клетки, след което преминава в алантоисната течност. Инфекцията се извършва по следния начин: в черупката над въздушната камера се прави пункция с върха на скалпел или ножица, след което през отвора във вертикална посока се вкарва игла със спринцовка, която преминава през хорионалантоисната мембрана и навлиза в алантоисната кухина, материалът се инжектира в обем от 0,1 ml и дупката се запълва с парафин.
Инфекция в жълтъчната торбичка.За целта се използват ембриони на 5-10-дневна възраст. Има два най-често използвани метода за заразяване. Според първия материалът се въвежда през въздушното пространство. В центъра на яйцето се прави дупка, поставя се върху стойка с тъп край вдясно и през отвора във вертикална посока се вкарва игла, поставена на спринцовка, иглата преминава през хорионалалантоичната мембрана, алантоичната кухина в жълтъка. В жълтъчната торбичка могат да се инжектират от 0,1 до 0,5 ml вирус-съдържащ материал. След заразяване дупката в черупката се запълва с парафин и ембрионът се поставя в термостат. Съгласно втория метод, на границата на въздушното пространство от страната, където лежи жълтъкът (страната, противоположна на ембриона), се прави пункция на черупката, през която се инжектира инфекциозен материал. Посоката на иглата трябва да е към центъра на яйцето.
Пилешки ембрион, заразен с вирусен материал, се поставя в инкубатор за 2-3 дни, в зависимост от естеството на внесения вирус. За развитието на вируси от проби, взети от пациент (например тампони от назофаринкса, използвани при диагностициране на грип), пилешкият ембрион осигурява добра среда. По вида на промените, да речем, в тъканите на хориоалантоичната мембрана, можем директно да определим с кой вирус имаме работа. Вирусите на едра шарка и херпес дават много характерни промени. Някои вируси се размножават много интензивно в различни тъкани на пилешкия ембрион и осигуряват изходен материал за приготвянето на вирусни антигени, необходими за лабораторната диагностика на вирусни заболявания. Вирусите, размножени в пилешкия ембрион, бяха използвани като изходен материал за получаване на осемнадесет вида ваксинационни ваксини.
Въпреки положителните аспекти на клетъчните култури, които са станали толкова разпространени в съвременните вирусологични лаборатории, пилешкият ембрион е запазил своето първостепенно значение в много случаи и все още служи като класически материал за работа. Индикацията за наличие на вируса в пилешкия ембрион се извършва чрез смъртта на ембриона, положителна реакция на хемаглутинация върху стъкло с алантоична или околоплодна течност, чрез образуване на фокални лезии („плаки“) върху хорион-алантоичната мембрана, както и в RHA.
Съдържание на темата "Култивиране на бактерии. Методи за култивиране на бактерии. Признаци на колонии.":Органни култури за откриване на вируси. Пилешки ембриони при диагностициране на вирусни инфекции. Инфекция с вируса на пилешки ембриони. Методи за заразяване с вирус на пилешки ембриони.
Не всички видове клетки могат да растат под формата на монослон; в някои случаи поддържането на диференцирани клетки е възможно само в култура на органи. Обикновено това е суспензия от тъкан със специализирана функция, наричана още оцеляла тъканна култура.
Пилешки ембриони при диагностициране на вирусни инфекции
пилешки ембриони(фиг. 11-20) са почти идеални модели за култивиране на някои вируси (например грип и морбили). Затворената кухина на ембриона предотвратява проникването на микроорганизми отвън, както и развитието на спонтанни вирусни инфекции. Ембрионите се използват за първично изолиране на вируси от патологичен материал; за преминаването и съхраняването им, както и за получаването на необходимите количества вирус. Някои патогени (например херпесвируси) причиняват характерни промени (те могат да се използват за разпознаване на заболяването). Инфекцията се извършва върху хорион-алантоичната мембрана, в амниотичната или алантоичната кухина или в жълтъчната торбичка.
Вирусна инфекция на хорион-алантоисната мембрана. Обикновено се използват 10-12 дневни ембриони. Яйцата се разглеждат в пропусната светлина, отбелязва се локализацията на въздушната торбичка и се избира зона без съдове. Внимателно отстранете фрагмент от черупката, освободете външната обвивка и я отлепете с лек натиск. След това се прави дупка в ръба на въздушната възглавница. При засмукване през този отвор, хорион-алантоисната мембрана се ексфолира от външната обвивка. Върху него се нанася тестовият материал, освободен от бактерии и протозои (преминал през бактериални филтри и третиран с бактерициди). Инфекция в амниотичната кухина. Обикновено се използват 7-14-дневни ембриони, при които след ексфолиране на хорион-алантоичната мембрана (виж по-горе) отворът се разширява, амниотичната мембрана се улавя с пинсети и се отстранява през хорион-алантоисната мембрана. Чрез него тестовият материал се въвежда в околоплодната кухина.
Вирусна инфекция в алантоисната кухина. 10-дневните ембриони се заразяват през дупки, направени в черупката и подлежащите мембрани (вижте по-горе).
Вирусна инфекция в жълтъчната торбичка. Използват се 3-8-дневни ембриони, при които на тази възраст жълтъчната торбичка заема почти цялата кухина на яйцето. Инфекцията се извършва през дупка, направена във въздушната торбичка.
Ориз. 11-20. Схематично представяне на развиващ се пилешки ембрион.
Наблюдение и записване на резултатите от заразяване с вируса на пилешки ембриони
Съдържанието може да се използва като вирус-съдържащ материал жълтъчен сак, алантоичната и околоплодната течности или целия ембрион, нарязан на парчета заедно с околните тъкани. За идентифициране на характерни лезии на хорион-алантоисната мембрана, черупката и външната обвивка се отстраняват. След това мембраната се отстранява и се поставя в стерилна вода. Естеството на лезиите се изследва на тъмен фон.
Цел на урока
Да запознае учениците с методите за подбор на пилешки ембриони за култивиране на вируси.
Оборудване и материали
Пилешки ембриони 9-12 дни инкубационна възраст, овоскоп, тампони със спирт, стойки за ембриони, пинсети, ножици, лейкопласт, игли, спринцовки, моливи, перфоратори, игли, маси, диаграми, мултимедийно оборудване, презентации MS Office PowerPointпо темата на урока.
Методиката на урока и методически указания по темата
Обяснение на учителя
Култивирането на вируси върху пилешки ембриони е най-достъпният и удобен метод за първично изолиране на вируса. Практиката на използване на този метод на заразяване показа редица предимства пред другите методи. За инфекция се използват ембриони от 5-12 дни инкубация.
ПРЕДИМСТВА И НЕДОСТАТЪЦИ НА ПИЛЕШКИ ЕМБРИОНИ КАТО БИОЛОГИЧНИ ОБЕКТИ
Култивирането на вируси в пилешки ембриони е най-достъпният и удобен метод както за първично изолиране на вируси от болни животни и от обекти на околната среда, така и за последващо култивиране на вируси в лаборатория. Този метод се използва широко за идентифициране на вируси и антитела, както и за приготвяне на ваксини и диагностика. Практиката на приложение показа редица предимства на този метод пред култивирането на вируси върху лабораторни животни. Известно е, че белите мишки, които се използват широко във вирусологичните изследвания, могат спонтанно да се заразят с редица вирусни инфекции: ектромелия, лимфоцитен хориоменингит, енцефалит на Тейлър, вирусна пневмония, вирус Сендай и други, което значително усложнява работата и често води до погрешни заключения при оценка на получените резултати. Култивирането на вируси върху пилешки ембриони до голяма степен елиминира горните трудности. Заедно с това от пилешки ембрион може да се получи много повече вирус, отколкото от лабораторни животни. Пилешкият ембрион има по-голяма жизнеспособност и устойчивост на различни видове влияния, които са неизбежни при въвеждане на тестовия материал. При познато умение за работа с ембриони и спазване на правилата за асептика тяхната смърт е незначителна. Най-голямо разхищение на ембриони се получава при вкарване на материала в амниотичната кухина и жълтъчната торбичка, но дори и в тези случаи не надвишава 10–15% при спазване на необходимите условия за инкубация.
Пилешките ембриони като жива система навлизат в вирусологичната практика през 30-те години на миналия век. Използването им разшири гамата от вируси, култивирани в лабораторията, направи възможно по-успешното решаване на проблемите, пред които е изправена вирусологията поради факта, че пилешките ембриони имат редица предимства пред лабораторните животни: 1) черупката и мембраната на черупката надеждно защитават ембрион от бактериална инфекция от външната среда; 2) важно предимство на ембрионите е и тяхната висока чувствителност към широк спектър от вируси, което се обяснява с недостатъчното развитие на защитните механизми; 3) пилешките ембриони са леснодостъпен обект поради развитието на широка мрежа от птицеферми и люпилни; 4) пилешките ембриони са икономични, не изискват грижи и хранене.
Основните недостатъци са: 1) невъзможността да се гарантира напълно стерилността на тази жива система, тъй като ембрионите могат да пренасят в съдържанието си вируси и други патогенни агенти (вируси на инфекциозен бронхит на пилета, нюкасълска болест, грип, левкемия, хламидия и микоплазма). . Тяхното присъствие може да изкриви резултатите от изследването; 2) пилешките ембриони не са чувствителни към всички вируси.
ЦЕЛ НА ИЗПОЛЗВАНЕ НА ПИЛЕШКИ ЕМБРИОНИ
Пилешките ембриони се използват във вирусологията главно за същите цели като лабораторните животни, а именно:
– откриване на активен вирус в патологичния материал чрез биоанализ;
- първично изолиране на вируса. Вирусите, които причиняват заболявания при птиците, както и някои вируси на бозайници, са ефективно изолирани и култивирани върху пилешки ембриони;
– поддържане на вируси в лабораторията;
– титруване на вируси;
- натрупване на вируса за лабораторни изследвания и ваксини;
– като тест обект в реакцията на неутрализация.
ИЗИСКВАНИЯ КЪМ ПИЛЕШКИ ЕМБРИОНИ
Яйцата трябва да се получават от ферми без вируси. В оплодените яйца, дори от клинично здрави пилета, могат да се открият различни вируси, открити при тези птици: Нюкасълска болест, инфекциозен бронхит, инфекциозен ларинготрахеит, енцефаломиелит, параинфлуенца-2, полиартрит, едра шарка, арбовируси, аденовируси и др. Наличие на тези вируси и др. може, от една страна, да доведе до диагностични грешки, а от друга страна, въз основа на феномена на интерференция, да потисне възпроизвеждането на вируса в тестовата проба. Ембриони без вируси от кокошки, които са асимптоматично заразени с определени вируси, също могат да бъдат по-малко чувствителни или напълно нечувствителни към действието на този вирус поради наличието на специфични антитела, получени от майката с жълтък. За успешното изолиране на вируса е необходимо пилетата, чиито ембриони се използват в работата, да не са ваксинирани срещу болестта, чийто причинител се търси. Черупката на яйцата трябва да е непигментирана, чиста (не може да се мие). Възрастта на ембриона трябва да е подходяща за избрания метод на заразяване.
За да се осигури нормалното развитие на ембрионите в оплодените яйца по време на инкубационния период, е необходимо да се поддържа определена температура и влажност. Развиващите се ембриони понасят топлината много по-лошо от студа. Следователно, краткотрайна (в рамките на няколко часа) повреда в отоплителната система не причинява много вреда. За по-дълги почивки е необходимо отопление.
Инкубираните яйца се нуждаят от свободен достъп до свеж въздух, който влиза през вентилационни отвори. Те винаги трябва да са отворени. Едно яйце, както се смята, консумира 1 литър кислород на ден, което не е изненадващо, ако си припомним бързото развитие на ембриона по време на 21 дни инкубация. Ето защо яйцата не трябва да се поставят близо едно до друго, както и едно върху друго. Конвенционалните термостати не са подходящи за инкубиране на яйца. Само в спешни случаи те могат да се използват за тези цели, но в същото време често се проветряват и вътре се поставя съд с вода, за да се осигури необходимата влажност.
Снесените за инкубация яйца се осветяват след 3-5 дни с помощта на специална настолна или ръчна (ако яйцата не са извадени от тавата на инкубатора) за избор на неоплодени. Яйцата на Leghorn са най-удобни за вирусологична работа, тъй като тънката им бяла черупка ви позволява да видите по-добре съдържанието. Неоплодените или съдържащи мъртви ембриони яйца се отстраняват от инкубатора. Делът на оплодените яйца варира значително в зависимост от много фактори, включително времето на годината: през пролетта е най-високо, през зимата е най-ниско.
Вторият път ембрионите са полупрозрачни в деня на планираната инфекция. Този период зависи от вида на вируса, както и от начина на неговото въвеждане. Върху черупката с обикновен (не мастилен) молив маркирайте мястото на инфекция.
СТРУКТУРА НА ПИЛЕШКИ ЕМБРИОН
Обикновено кокошката снася оплодено яйце, в което ембрионът е на етап бластула или ранен стадий на гаструла. Когато яйцето се нагрее до температура, близка до телесната температура на пилето, настъпва по-нататъшно развитие на ембриона (фиг. 15). През периода от 5-ия до 12-ия ден от инкубацията, пилешки ембриони могат да се използват за заразяване с вируси.
Фигура 15 - Схематичен разрез на пилешки ембрион на 8-ия ден от инкубацията: 1 - черупка; 2 - обвивна мембрана; 3 - хориоалантоична мембрана; 4 - алантоична кухина; 5 - жълтъчна торбичка; 6 - протеин; 7 - въздушна камера; 8 - тялото на ембриона; 9 - амниотична кухина
Яйцето с развиващ се пилешки ембрион е покрито отвън с твърда пореста черупка, към която е плътно прикрепена обвивката на черупката. Последният в тъпия край на яйцето се разделя на два листа, между които се образува въздушна камера. Тялото на ембриона лежи ексцентрично в яйцето, като гърбът му е по-близо до черупката, главата е насочена към въздушната камера. Ембрионът е потопен в амниотичната течност, която изпълва околоплодната кухина, и е свързан с жълтъка чрез пъпната връв. Жълтъкът също е разположен ексцентрично и спрямо ембриона, като че ли, от другата страна на надлъжната ос.
Непосредствено под обвивката на черупката има алантоична кухина, покриваща амниона и жълтъчната торбичка, а към 10-11-ия ден тя се затваря в острия край на яйцето. В процеса на развитие алантоисната мембрана се слива с хориона, образувайки единна хорионалантоична мембрана (CAO). В острия край на яйцето е останалата част от протеина.
Инфекцията в една или друга част на ембриона се извършва в периода на максималното му развитие, когато броят на чувствителните клетки ще бъде най-голям.
В процеса на инкубация размерите на ембрионалните структури се променят, което до голяма степен се дължи на функционалното им предназначение и определя оптималната възраст на ембриона за инфекция.
Така жълтъчната торбичка като резервоар на хранителни вещества има най-голям обем в началото на инкубацията, а след това (след 12-ия ден) с развитието на ембриона намалява. Инфектирайте в жълтъчната торбичка от 5-ия до 7-ия ден от инкубацията.
Амниотичната кухина, като буферна среда за развитието на ембриона, я покрива още на 5-ия ден от инкубацията. Средното количество течност до средата на инкубационния период е около 1 ml.
За инфекция в амниотичната кухина се използват ембриони на възраст 6-10 дни.
Алантоичната кухина служи за събиране на метаболитни продукти; в нея се натрупват соли на пикочната киселина, фосфор и азотни съединения. В процеса на растеж и развитие на ембриона алантоичната течност става кисела. Алантоисната кухина достига максималния си размер на 9-12-ия ден от развитието на ембриона, следователно инфекцията в алантоичната кухина се извършва главно на 9-11-ия ден от инкубацията.
Хориоалантоичната мембрана е богата на кръвоносни съдове, които, плътно прилепнали към вътрешната повърхност на порестата обвивка, са наситени с кислород и снабдяват тялото на ембриона с него, изпълнявайки функцията на дихателния орган на ембриона. Максималното развитие на HAO достига на 11-13-ия ден. Инфекцията върху хориоалантоисната мембрана се извършва на 10-12-ия ден от инкубацията.
ПОДГОТОВКА НА ПИЛЕШКИ ЕМБРИОНИ ЗА ИНФЕКЦИЯ
Ембрионите се доставят от люпилнята, без да се охлаждат по пътя. В лабораторията ембрионите се инкубират в термостат при температура 37 °C и влажност 60-70%, което се постига чрез поставяне на отворени съдове с широко гърло с вода в термостата. Отворите на термостата трябва да са отворени. Ембрионите се поставят с въздушната камера нагоре в специални стойки. Препоръчително е ембрионите да се адаптират към новите условия през деня и да нормализират функциите си след транспортен стрес до момента на заразяване. Ако лабораторията разполага със собствена люпилня, тогава оплодените яйца, снесени от кокошката, са подходящи за снасяне в нея за 10 дни.
Подготовката на пилешки ембриони за инфекция включва осветяване и дезинфекция на черупката, както и подходяща подготовка на работното място. Свещването е гледането на яйца срещу достатъчно ярък източник на светлина (овоскоп), в резултат на което се образуват сенки от вътрешни структури от неосветената страна на черупката (фиг. 16). Свещването се извършва в затъмнена стая. В същото време границата на въздушната камера, местоположението на ембриона и зоната на аваскуларната зона с размери 0,5x0,5 см са маркирани върху черупката с графитен молив. Тези марки служат като ориентир при избора мястото за въвеждане на вирусосъдържащия материал. При свещване се определя и дали ембрионът е жив или мъртъв. За живи се считат ембрионите, които показват активни движения с добро кръвоснабдяване на съдовете CAO.
Фигура 16 - Осветяване на пилешки ембрион на 10-ия ден от инкубацията. Виждат се сенки: 1 - ембрион; 2 - жълтъчна торбичка; 3 - кръвоносни съдове на CAO; 4 - въздушна камера; 5 - протеин
Пилешките ембриони се заразяват при асептични условия (за предпочитане в кутия). В предварителната кутия черупките на ембрионите се обработват с йодиран спирт, след което се избърсват многократно в кутията, а понякога се и фламбират - обработват се с пламък от тампон, напоен със спирт.
Ембрионите се фиксират в специални стойки, поставени в емайлирана кювета върху 3–4-слойна марля, навлажнена с дезинфекционен разтвор.
В работата се използват стерилизирани с кипене инструменти. Те се поставят в буркан с алкохол и се изгарят с пламък на горелка преди всяка повторна употреба.
Демонстрация
а) клинични признаци на заболяване при заразени лабораторни животни; б) методи за умъртвяване на лабораторни животни; в) техники за аутопсия (привличат вниманието на учениците към състоянието на вътрешните органи) и техники за получаване на вирусосъдържащ материал; г) техники за създаване на мозъчни отпечатъци; д) действия по обеззаразяване на работното място и трупа след отваряне на заразеното животно.
Задачи
1. Проучете структурата на пилешкия ембрион.
2. Извършете овоскопия на пилешки ембрион, определете неговата жизнеспособност и маркирайте границите на сенките на естествените образувания.
3. Подгответе пилешки ембриони за инфекция.
Самостоятелна работа на учениците
а) разпознаване на мишки, заразени от всеки от учениците по цветна маркировка, анализ на клиничното им състояние, умъртвяване, фиксиране в кювета с восъчно (парафиново) дъно, аутопсия; б) анализ на патологоанатомични изменения, получаване на вирус-съдържащ материал (паренхимни органи), изготвяне на послойни отпечатъци от мозъка.
Студентите провеждат овоскопия на пилешки ембрион, определят неговата жизнеспособност и маркират границите на сенките на естествените образувания.
Обобщаване на урока
Задача за следващия урок
Контролни въпроси
1. Структурата на пилешкия ембрион.
2. Защо пилешките ембриони се използват във вирусологията?
3. Каква е структурата на развиващия се пилешки ембрион?
