Uzgoj virusa u pilećim embrijima. Pileći embrij Načini zaraze pilećeg embrija virusom
pileći embrion pileći embrion
(CE) - pileći embrij u različitim fazama embrionalnog razvoja. U mikrobiol. praksa se koristi za izolaciju, uzgoj i identifikaciju virusa, rikecija i ponekad bakterija. Za laboratorijske potrebe odabiru se svježe, oplođene, EC školjke dobro prozirne i bez pukotina. Inkubacija se provodi u gnijezdima tronošca s tupim krajem jajeta gore u dobro prozračenim inkubatorima ili termostatima na 37-37,5°C, relativna vlažnost zraka 63-65%. Za infekciju se odabiru embriji stari 4-13 dana s izraženim krvnim žilama, žumanjčanom vrećicom i pokretnom sjenom. Prije infekcije, ljuske jaja se tretiraju alkoholom, spaljuju, a u području ubrizgavanja (često iznad zračne komore) namažu se 2% tinkturom joda. Materijal ili istraživanje. to-ru se unosi, otvarajući ili ne otvarajući ljusku, u žumanjčanu vrećicu (rikecije), u alantoične ili amnionske šupljine (većina virusa), nanosi se na korion-alantoičnu membranu. Rjeđe se to-ru ubrizgava u tijelo embrija ili intravenozno. Inficirani EC se stavljaju u termostat pod uvjetima i na periode koji ovise o vrsti mikroba i ciljevima studije. Neki podaci o rezultatima infekcije mogu se dobiti vanjskim pregledom EK pod mikroskopom (injekcija žile, gubitak pokretljivosti i sl.). Međutim, u većini slučajeva otvara se CE. Da bi se to postiglo, nakon tretmana alkoholom i jodnom tinkturom, ljuska se odsiječe iznad granice zračne vrećice, alantoična, a zatim se plodna voda isiše Pasteurovom pipetom ili štrcaljkom, izbjegavajući oštećenje krvnih žila i žumanjka. sac. Zametak i korionalantoična membrana se uklanjaju iz ljuske, stavljaju u sterilne čaše, ispiru sterilnim destilatom. vodu i pregledati. Daljnji tijek proučavanja embrija i njegovih tekućina ovisi o vrsti mikroba ili virusa i ciljevima pokusa.
(Izvor: Rječnik mikrobioloških pojmova)
Pogledajte što je "pileći embrij" u drugim rječnicima:
EMBRIOTOKSIČNOST- embriotoksičnost, sposobnost fizikalnih, bioloških, kemijskih i drugih agensa da imaju negativan učinak na embrij u razvoju. Embriotoksični učinak različitih tvari utvrđuje se izlaganjem ženki ... ... Veterinarski enciklopedijski rječnik
"Kokoši" preusmjerava ovdje; vidi i druga značenja. ? Domaća piletina ... Wikipedia
Pilići Pilići su ukras svakog dvorišta Znanstvena klasifikacija Kraljevstvo: Životinje Vrsta: Hordati Razred ... Wikipedia
Od otkrića da se virusi gripe repliciraju u pilećim embrijima, ova metoda se široko koristi u virologiji jer je jednostavna za korištenje i jeftina.
Koristite pileće embrije stare 7-9 dana (potpuni razvojni ciklus 21 dan).
Prije infekcije, površina se tretira alkoholom, otopinom joda, napravi se rupa u ljusci i inficira sterilnom špricom.
Načini infekcije: u amnionsku šupljinu, u alantoičnu šupljinu ili u žumanjčanu vrećicu. Virusi se razmnožavaju na odgovarajućim membranama, akumuliraju se u šupljinskoj tekućini, koja se zatim može prikupiti za daljnja istraživanja.
Embriji se uzgajaju na 37°C. 3 dana, zatim se ljuska ponovno obrađuje, embrij se otvara sterilnim instrumentima i prikuplja se tekućina koja sadrži virus. Svi radovi na infekciji i obdukciji provode se u boksu.
Uzgoj na staničnim kulturama.
U virusologiji se posljednjih desetljeća koriste stanične kulture, što je omogućilo uzgoj i proučavanje mnogo šireg spektra virusa, budući da se svi ljudski virusi ne mogu izolirati u životinjama ili embrijima. Dakle, moderna virologija koristi kulture stanica, kojih trenutno postoji ogroman broj.
Sorte staničnih kultura
a) primarni dobiveno iz embrionalnog tkiva, mljevenjem, obradom tripsinom radi dezagregacije (odvajanja) stanica i daljnjeg uzgoja
in vitro u posebnoj tekućini za kulturu.
b) presađeno- dobiveni iz tumorskog tkiva, razlikuju se po tome što se mogu uzgajati neograničeno, mijenjajući samo medij kulture i pribor.
Tijekom uzgoja dobiva se monosloj na staklu. : odnosno jedan sloj stanica.
Sada je moguće zaraziti te stanice ispitnim materijalom sa sumnjivim virusom ili već postojećim virusima. Posude sa stanicama, zaražene i neinficirane, uzgajaju se u termostatu na 37 stupnjeva.
Proces nakupljanja viriona u staničnoj kulturi traje približno 48 - 72 sata.
Uz prikladne kulture, gotovo svi ljudski virusi mogu se uzgajati.
Sljedeća faza proučavanja je indikacija i identifikacija virusa.
Metode prikaza.
Indikacija - to je otkrivanje virusa izravno u ispitivanom materijalu ili u tekućini kulture ili u inficiranim stanicama.
I. Ako su virioni u tekućini, tada se mogu detektirati pomoću reakcije hemaglutinacije.
Bit reakcije: neke vrste virusa mogu se spontano zalijepiti zajedno (to jest, izazvati hemaglutinaciju) bilo koje crvene krvne stanice. Na primjer, virioni gripe lijepe pileće eritrocite, neki adenovirusi lijepe eritrocite štakora itd.
Dakle, korištenjem suspenzije eritrocita u fiziološkoj otopini, moguće je otkriti viruse u tekućini koja sadrži virus.
II. Ako se virusi razmnožavaju u staničnoj kulturi, ali hemaglutiniraju, tada se mogu otkriti reakcijom hemadsorpcije: suspenzija crvenih krvnih stanica se nanosi na kulturu, inkubira, drenira - ako je kultura zaražena, tada će crvena krvna zrnca zalijepiti izravno na zaražene stanice - to se može vidjeti u svjetlosnom mikroskopu.
III Ostali učinci:
a) virusi uzrokuju uništenje monosloja – to se naziva citopatogenim djelovanjem virusa – CPE.
b) virusi uzrokuju morfološke promjene u stanicama: intracelularne ili intranuklearne inkluzije, stvaranje sincicija, simplasta (tj. spajanje više stanica u jednu formaciju zbog oštećenja staničnih membrana).
Većina poznatih virusa ima sposobnost razmnožavanja u pilećem embriju (slika 4.). Embriji se koriste u dobi od 8 do 14 dana, ovisno o vrsti virusa, načinu infekcije i ciljevima istraživanja. Virusi gripe uzgajaju se na 9-10, cjepiva protiv velikih boginja - na 12, zaušnjaci - u 7-dnevnim pilećim embrijima. Reprodukcija virusa u pilećim embrijima događa se u različitim dijelovima embrija, što je povezano s osobitostima tropizma virusa. Metoda uzgoja virusa u pilećem embriju naširoko se koristi u industrijskom uzgoju.
Struktura pilećeg embrija i metode infekcije: 1 - u amniju; 2 - u alantoičnu šupljinu; 3 - u vrećici žumanjka. (Mikrobiologija i imunologija. Uredio Vorobyov A.A. - M. - 1999.).
Najudaljenija ekstraembrionalna membrana, uz ljusku ili majčino tkivo i stoga služi kao mjesto razmjene između embrija i njegove okoline, naziva se Korion. Kod vrsta koje polažu jaja, glavna funkcija koriona je provedba respiratorne izmjene plinova. U sisavaca korion sudjeluje u disanju i prehrani, izlučivanju, filtraciji i sintezi tvari. Kod primitivnih organizama horion je sekundarna membrana, dok je u naprednih organizama membrana fetusa. Šupljina između koriona i amniona je korionamniotska.
Vodenjak(grč. Amnion), amnionska vrećica ili vodena membrana – jedna od embrionalnih membrana u embrionima gmazova, ptica, sisavaca.
Evolucijski, amnion je nastao kako bi zaštitio embrije od isušivanja tijekom razvoja izvan vodenog okoliša. Stoga se kralježnjaci koji polažu jaja (gmazovi i ptice), kao i sisavci koji potječu od gmazova, svrstavaju u amniote ("Životinje s ljuskom jajeta"). Prethodni razredi i nadrazredi kralježnjaka (cefalohordati, ciklostomi, ribe, vodozemci) polažu jaja u vodeni okoliš, pa im nije potrebna vodena ljuska. Ove klase životinja objedinjene su u skupinu anamnija. Za razliku od anamnije, amnioti ne zahtijevaju vodeni okoliš za razmnožavanje i rani razvoj, pa amnioti nisu vezani za vodena tijela. Ovo je evolucijska uloga amniona.
Tijekom rođenja sisavaca, vodena školjka puca, voda istječe, a ostaci amniona na tijelu novorođenčeta često se nazivaju "košuljom", što je od davnina znak sreće i drugih praznovjerja ( otuda, osobito, ruska poslovica o onima koji su "rođeni u košulji").
Allantois (od grč. allantoeid?s - u obliku kobasice) - embrionalni dišni organ viših kralježnjaka; zametnu membranu koja se razvija iz stražnjeg crijeva embrija. Osim toga, alantois je uključen u izmjenu plinova embrija s okolinom i oslobađanje tekućeg otpada. Alantois, zajedno s drugim embrionalnim membranama - amnionom i korionom, definirajuća je značajka viših kralježnjaka - sisavaca, ptica i gmazova.
Kod ptica i gmazova ovipare alantois se razvija oko embrija duž stijenki ljuske. U svom vanjskom sloju, nazvanom mezoderm, stvara opsežnu mrežu krvnih žila kroz koje stupa u interakciju s vanjskim okruženjem. U sisavaca, alantois je dio pupčane vrpce.
Postoji nekoliko načina da se zarazi pileći embrij u razvoju: na korionalantoičnu membranu, u alantoičnu i amnionsku šupljinu, u žumanjčanu vrećicu i u tijelu embrija.
Infekcija na korionalantoičnoj membrani koristi se za izolaciju i uzgoj virusa koji stvaraju plakove na membranama (virusi cjepiva, velikih boginja, herpes simplex virusa). Prije infekcije jajašca su prozirna ovoskopom, olovkom se ocrtava granica zračnog prostora i korioalantoične membrane. Površina jaja iznad zračnog prostora i na mjestu infekcije obriše se alkoholom, spali, tretira jodom i napravi se rupa u šupljini zračne vrećice.
Na mjestu infekcije ljuska se uklanja kako se ne bi oštetila membrana ljuske, koja se zatim probuši kratkom sterilnom iglom kako se ne bi oštetila korionalantoična membrana. Usisava se zrak iz šupljine zračnog jastuka. Virusni materijal (0,05 - 0,2 ml) nanosi se na korionalantoičnu membranu tuberkulinskom štrcaljkom s kratkom iglom ili Pasteurovom pipetom. Otvor u ljusci zatvori se sterilnim pokrovnim staklom ili istim izrezanim komadom ljuske i po rubovima se napuni rastopljenim parafinom. Zaraženi embriji se postavljaju vodoravno na stalak i inkubiraju u termostatu. Embriji se otvaraju ne prije 48 sati od inkubacije. Na zaraženoj ljusci nalaze se bjelkaste neprozirne mrlje različitih oblika (plakovi).
Infekcija u alantoičnoj šupljini. Virus uveden u alantois razmnožava se u endodermalnim stanicama, a zatim prelazi u alantoisnu tekućinu. Infekcija se provodi na sljedeći način: u ljusci iznad zračne komore vrši se ubod vrhom skalpela ili škara, nakon čega se kroz otvor u okomitom smjeru uvlači igla sa štrcaljkom koja prolazi kroz korionalantoičnu membranu i ulazi u alantoičnu šupljinu, materijal se ubrizgava u volumenu od 0,1 ml i rupa se puni parafinom.
Infekcija u žumanjčanoj vrećici. U tu svrhu koriste se embriji od 5-10 dana starosti. Dvije su najčešće korištene metode infekcije. Prema prvom, materijal se unosi kroz zračni prostor. U sredini jajeta se napravi rupica, stavi se na postolje s tupim krajem udesno, a kroz otvor u okomitom smjeru ubode se igla stavljena na špricu, igla prolazi kroz korionalantoičnu membranu, alantoičnu šupljina u žumanjak. U žumanjčanu vrećicu može se ubrizgati od 0,1 do 0,5 ml materijala koji sadrži virus. Nakon infekcije, rupa u ljusci se puni parafinom, a embrij se stavlja u termostat. Prema drugoj metodi, na granici zračnog prostora na strani gdje leži žumanjak (strana suprotna od embrija) radi se ubod ljuske kroz koju se ubrizgava infektivni materijal. Smjer igle treba biti prema središtu jajeta.
Pileći embrij zaražen virusnim materijalom stavlja se u inkubator na 2-3 dana, ovisno o prirodi unesenog virusa. Za razvoj virusa iz uzoraka uzetih od pacijenta (na primjer, bris iz nazofarinksa koji se koristi u dijagnosticiranju gripe), pileći embrij pruža dobro okruženje. Po vrsti promjena, recimo, u tkivima korioalantoične membrane, možemo izravno odrediti s kojim virusom imamo posla. Virusi velikih boginja i herpesa daju vrlo karakteristične promjene. Neki se virusi vrlo intenzivno razmnožavaju u različitim tkivima pilećeg embrija i daju polazni materijal za pripremu virusnih antigena potrebnih za laboratorijsku dijagnostiku virusnih bolesti. Virusi razmnoženi u pilećem embriju korišteni su kao polazni materijal za dobivanje osamnaest vrsta cjepiva za cijepljenje.
Unatoč pozitivnim aspektima staničnih kultura, koje su postale toliko raširene u modernim virološkim laboratorijima, pileći embrij je u mnogim slučajevima zadržao svoju primarnu važnost i još uvijek služi kao klasičan materijal za rad. Indikacija virusa u pilećem embriju nastaje smrću embrija, pozitivnom reakcijom hemaglutinacije na staklu s alantoičnom ili amnionskom tekućinom, stvaranjem fokalnih lezija („plakova“) na korion-alantoičnoj membrani, kao i u RHA.
Sadržaj predmeta "Uzgoj bakterija. Metode uzgoja bakterija. Znakovi kolonija.":Kulture organa za otkrivanje virusa. Pileći embriji u dijagnostici virusnih infekcija. Infekcija virusom pilećih embrija. Metode infekcije virusom pilećih embrija.
Nisu sve vrste stanica sposobne rasti u obliku monoslona; u nekim slučajevima održavanje diferenciranih stanica moguće je samo u kultura organa. Obično je to suspenzija tkiva sa specijaliziranom funkcijom, koja se također naziva preživjela kultura tkiva.
Pileći embriji u dijagnostici virusnih infekcija
pilećih embrija(Sl. 11-20) su gotovo idealni modeli za uzgoj nekih virusa (primjerice, gripe i ospica). Zatvorena šupljina embrija sprječava prodiranje mikroorganizama izvana, kao i razvoj spontanih virusnih infekcija. Embriji se koriste za primarnu izolaciju virusa iz patološkog materijala; za njihovo prenošenje i čuvanje, kao i za dobivanje potrebnih količina virusa. Neki patogeni (na primjer, herpesvirusi) uzrokuju karakteristične promjene (mogu se koristiti za prepoznavanje bolesti). Infekcija se provodi na korion-alantoičnoj membrani, u amnionskoj ili alantoičnoj šupljini ili u žumanjčanoj vrećici.
Virusna infekcija na horion-alantoičnoj membrani. Obično se koriste embriji stari 10-12 dana. Jaja se promatraju u propuštenom svjetlu, bilježi se lokalizacija zračne vrećice i odabire se područje bez krvnih žila. Pažljivo uklonite dio ljuske, otpustite vanjsku ljusku i ogulite je blagim pritiskom. Zatim se napravi rupa na rubu zračnog jastuka. Prilikom usisavanja kroz ovu rupu, korion-alantoična membrana se ljušti s vanjske ljuske. Ispitni materijal se nanosi na njega, bez bakterija i protozoa (propušten kroz bakterijske filtere i tretiran baktericidima). Infekcija u amnionskoj šupljini. Obično se koriste embriji stari 7-14 dana, kod kojih se nakon ljuštenja korion-alantoične membrane (vidi gore) otvor proširi, pincetom se uhvati amnionska membrana i ukloni kroz horion-alantoičnu membranu. Kroz njega se ispitni materijal unosi u amnionsku šupljinu.
Virusna infekcija u alantoičnoj šupljini. 10-dnevni embriji inficirani su kroz rupe napravljene u ljusci i membranama ispod njih (vidi gore).
Virusna infekcija u žumanjčanoj vrećici. Koriste se embriji stari 3-8 dana, u kojima u ovoj dobi žumanjčana vrećica zauzima gotovo cijelu šupljinu jajeta. Infekcija se provodi kroz rupu napravljenu u zračnoj vrećici.
Riža. 11-20 (prikaz, stručni). Shematski prikaz pilećeg embrija u razvoju.
Promatranje i bilježenje rezultata infekcije virusom pilećih embrija
Sadržaj se može koristiti kao materijal koji sadrži viruse žumanjčana vrećica, alantoične i amnionske tekućine, odnosno cijeli embrij, izrezan na komadiće zajedno s okolnim tkivima. Kako bi se identificirale karakteristične lezije na korion-alantoičnoj membrani, ljuska i vanjska ljuska se uklanjaju. Zatim se membrana ukloni i stavi u sterilnu vodu. Priroda lezija proučava se na tamnoj pozadini.
Svrha lekcije
Upoznati studente s metodama selekcije pilećih embrija za uzgoj virusa.
Oprema i materijali
Pileći embriji 9-12 dana inkubacijske dobi, ovoskop, alkoholni brisevi, stalci za embrije, pincete, škare, ljepljivi flaster, igle, šprice, olovke, bušilice, igle, stolovi, dijagrami, multimedijska oprema, prezentacije MS Office PowerPoint na temu lekcije.
Metodika sata i metodičke upute na temu
Objašnjenje učitelja
Uzgoj virusa na pilećim embrijima najpristupačnija je i najprikladnija metoda za primarnu izolaciju virusa. Praksa korištenja ove metode infekcije pokazala je niz prednosti u odnosu na druge metode. Za infekciju se koriste embriji od 5-12 dana inkubacije.
PREDNOSTI I NEDOSTACI PILEĆIH EMBRIJA KAO BIOLOŠKIH OBJEKATA
Uzgoj virusa u pilećim embrijima najpristupačnija je i najprikladnija metoda kako za primarnu izolaciju virusa iz bolesnih životinja i iz okolišnih objekata, tako i za naknadno uzgoj virusa u laboratoriju. Ova metoda se široko koristi za identifikaciju virusa i antitijela, kao i za pripremu cjepiva i dijagnostiku. Praksa primjene pokazala je niz prednosti ove metode u odnosu na uzgoj virusa na laboratorijskim životinjama. Poznato je da se bijeli miševi, koji se široko koriste u virološkim istraživanjima, mogu spontano zaraziti nizom virusnih infekcija: ektromelijom, limfocitnim koriomeningitisom, Taylorovim encefalitisom, virusnom upalom pluća, Sendai virusom i dr., što uvelike otežava rad i često dovodi do pogrešnih zaključaka pri ocjenjivanju dobivenih rezultata. Uzgoj virusa na pilećim embrijima uvelike otklanja gore navedene poteškoće. Uz to, puno se više virusa može dobiti iz pilećeg embrija nego iz laboratorijskih životinja. Pileći embrij ima veću održivost i otpornost na različite vrste utjecaja koji su neizbježni prilikom unošenja ispitnog materijala. Uz poznatu vještinu rada s embrijima i poštivanje pravila asepse, njihova smrt je zanemariva. Najveći gubitak embrija nastaje kada se materijal unese u amnionsku šupljinu i žumanjčanu vrećicu, ali ni u tim slučajevima ne prelazi 10-15% ako su ispunjeni potrebni uvjeti inkubacije.
Pileći embriji kao živi sustav ušli su u virološku praksu 1930-ih. Njihova uporaba proširila je raspon virusa uzgojenih u laboratoriju, omogućila uspješnije rješavanje problema s kojima se virologija suočava zbog činjenice da pileći embriji imaju niz prednosti u odnosu na laboratorijske životinje: 1) ljuska i ljuska membrana pouzdano štite embrij od bakterijske infekcije iz vanjskog okruženja; 2) važna prednost embrija je i njihova visoka osjetljivost na širok spektar virusa, što se objašnjava nedovoljnim razvojem zaštitnih mehanizama; 3) pileći embriji su lako dostupan objekt zbog razvoja široke mreže peradarskih farmi i mrijestilišta; 4) pileći embriji su ekonomični, ne zahtijevaju njegu i hranjenje.
Glavni nedostaci su: 1) nemogućnost da se u potpunosti jamči sterilnost ovog živog sustava, budući da embriji u svom sadržaju mogu nositi viruse i druge patogene (viruse infektivnog bronhitisa pilića, Newcastleske bolesti, gripe, leukemije, klamidije i mikoplazme). . Njihova prisutnost može iskriviti rezultate studije; 2) pileći embriji nisu osjetljivi na sve viruse.
SVRHA UPOTREBE PILEĆIH EMBRIJA
Pileći embriji se u virologiji koriste uglavnom u iste svrhe kao i laboratorijske životinje, i to:
– otkrivanje aktivnog virusa u patološkom materijalu biotestom;
- primarna izolacija virusa. Virusi koji uzrokuju bolesti kod ptica, kao i neki virusi sisavaca, učinkovito su izolirani i uzgajani na pilećim embrijima;
– održavanje virusa u laboratoriju;
– titracija virusa;
- nakupljanje virusa za laboratorijska istraživanja i cjepiva;
– kao ispitni objekt u reakciji neutralizacije.
ZAHTJEVI ZA PILEĆE EMBRIJE
Jaja se moraju nabaviti s farmi bez virusa. U oplođenim jajima, čak i od klinički zdravih pilića, mogu se naći različiti virusi pronađeni kod ovih ptica: Newcastleska bolest, infektivni bronhitis, infektivni laringotraheitis, encefalomijelitis, parainfluenca-2, poliartritis, velike boginje, arbovirusi, adenovirusi itd. Prisutnost ovih virusa itd. može, s jedne strane, dovesti do dijagnostičkih pogrešaka, a s druge strane, na temelju fenomena interferencije, suzbiti reprodukciju virusa u ispitnom uzorku. Embriji bez virusa kokoši asimptomatski zaraženih određenim virusima također mogu biti manje osjetljivi ili potpuno neosjetljivi na djelovanje ovog virusa zbog prisutnosti specifičnih antitijela dobivenih od majke sa žumanjkom. Za uspješnu izolaciju virusa potrebno je da se kokoši čiji se zameci koriste u radu ne cijepe protiv bolesti čiji se uzročnik traži. Ljuska jajeta mora biti nepigmentirana, čista (ne može se prati). Starost embrija mora odgovarati odabranoj metodi infekcije.
Kako bi se osigurao normalan razvoj embrija u oplođenim jajima tijekom razdoblja inkubacije, potrebno je održavati određenu temperaturu i vlažnost. Embriji u razvoju podnose toplinu mnogo lošije od hladnoće. Stoga, kratkotrajni (unutar nekoliko sati) kvar u sustavu grijanja ne čini mnogo štete. Za duže pauze potrebno je grijanje.
Inkubirana jaja trebaju slobodan pristup svježem zraku, koji ulazi kroz ventilacijske otvore. Uvijek moraju biti otvoreni. Jedno jaje, kako se uvriježeno vjeruje, troši 1 litru kisika dnevno, što ne čudi ako se prisjetimo brzog razvoja embrija tijekom 21 dana inkubacije. Zato se jaja ne smiju stavljati blizu jedno drugom, kao ni jedno na drugo. Konvencionalni termostati nisu prikladni za inkubaciju jaja. Samo u slučaju nužde mogu se koristiti u ove svrhe, ali u isto vrijeme često ventilirati i staviti posudu s vodom kako bi se osigurala potrebna vlažnost.
Jaja koja su položena za inkubaciju osvjetljavaju se nakon 3-5 dana pomoću posebne stolne ili ručne (ako se jaja ne vade iz posude inkubatora) svjetiljke za odabir neoplođenih. Leghorn jaja su najprikladnija za virološki rad, jer njihova tanka bijela ljuska omogućuje bolji uvid u sadržaj. Neoplođena jajašca koja sadrže mrtve embrije uklanjaju se iz inkubatora. Udio oplođenih jaja značajno varira ovisno o mnogim čimbenicima, uključujući doba godine: u proljeće je najveći, zimi najmanji.
Drugi put su embriji prozirni na dan planirane infekcije. To razdoblje ovisi o vrsti virusa, kao io putu njegovog unošenja. Na ljusci običnom (ne tintom) olovkom označite mjesto infekcije.
STRUKTURA PILEĆEG EMBRIJA
Obično kokoš snese oplođeno jaje u kojem je embrij u fazi blastule ili rane gastrule. Kada se jaje zagrije na temperaturu blisku tjelesnoj temperaturi piletine, dolazi do daljnjeg razvoja embrija (slika 15.). U razdoblju od 5. do 12. dana inkubacije pileći embriji mogu se koristiti za infekciju virusima.
Slika 15 - Shematski presjek pilećeg embrija 8. dana inkubacije: 1 - ljuska; 2 - membrana ljuske; 3 - korioalantoična membrana; 4 - alantoična šupljina; 5 - žumanjčana vrećica; 6 - protein; 7 - zračna komora; 8 - tijelo embrija; 9 - amnionska šupljina
Jaje s pilećim embrionom u razvoju prekriveno je izvana tvrdom poroznom ljuskom, na koju je membrana ljuske čvrsto pričvršćena. Potonji na tupom kraju jajeta podijeljen je na dva lista, između kojih se formira zračna komora. Tijelo embrija ekscentrično leži u jajetu, leđima bliže ljusci, glava je usmjerena prema zračnoj komori. Embrij je uronjen u amnionsku tekućinu koja ispunjava amnionsku šupljinu, a sa žumanjkom je povezan pupkovinom. Žumanjak se također nalazi ekscentrično i u odnosu na embrij, takoreći, s druge strane uzdužne osi.
Neposredno ispod membrane ljuske nalazi se alantoična šupljina koja prekriva amnion i žumanjčanu vrećicu, a do 10.-11. dana zatvara se u oštri kraj jajeta. U procesu razvoja, alantoična membrana se spaja s korionom, tvoreći jedinstvenu korionalantoičnu membranu (CAO). Na oštrom kraju jajeta nalazi se ostatak proteina.
Infekcija u jednom ili drugom dijelu embrija provodi se tijekom razdoblja njegovog maksimalnog razvoja, kada će broj osjetljivih stanica biti najveći.
U procesu inkubacije mijenjaju se dimenzije embrionalnih struktura, što je velikim dijelom posljedica njihove funkcionalne namjene i određuje optimalnu dob embrija za infekciju.
Dakle, žumanjčana vrećica kao rezervoar hranjivih tvari ima najveći volumen na početku inkubacije, a zatim (nakon 12. dana) kako se embrij razvija, smanjuje se. Inficirati u žumanjčanoj vrećici od 5. do 7. dana inkubacije.
Amnionska šupljina, kao tampon okolina za razvoj embrija, pokriva ga već 5. dana inkubacije. Prosječna količina tekućine do sredine razdoblja inkubacije je oko 1 ml.
Za infekciju u amnionskoj šupljini koriste se embriji u dobi od 6-10 dana.
Alantoična šupljina služi za prikupljanje metaboličkih proizvoda, u njoj se nakupljaju soli mokraćne kiseline, fosfor i dušikovi spojevi. U procesu rasta i razvoja embrija, alantoična tekućina postaje kisela. Alantoična šupljina dostiže svoju maksimalnu veličinu 9-12. dana razvoja embrija, stoga se infekcija u alantoičnoj šupljini provodi uglavnom 9-11. dana inkubacije.
Korioalantoična membrana bogata je krvnim žilama, koje su, usko prianjajući uz unutarnju površinu porozne ljuske, zasićene kisikom i opskrbljuju tijelo embrija njime, obavljajući funkciju embrijalnog dišnog organa. Maksimalni razvoj HAO doseže 11-13 dana. Infekcija na korioalantoičnu membranu provodi se 10-12 dana inkubacije.
PRIPREMA PILEĆIH EMBRIJA ZA INFEKCIJU
Embriji se isporučuju iz klijališta bez hlađenja na putu. U laboratoriju se embriji inkubiraju u termostatu na temperaturi od 37 °C i vlažnosti od 60-70%, što se postiže postavljanjem otvorenih posuda širokog grla s vodom u termostat. Otvori termostata moraju biti otvoreni. Embriji se postavljaju sa zračnom komorom prema gore u posebne stalke. Preporuča se omogućiti embrijima da se prilagode novim uvjetima tijekom dana i normaliziraju njihove funkcije nakon transportnog stresa do trenutka infekcije. Ako laboratorij ima vlastito mrijestilište, tada su oplođena jaja koja snese kokoš pogodna za nošenje u njemu 10 dana.
Priprema pilećih embrija za infekciju uključuje svijeće i dezinfekciju ljuske, kao i odgovarajuću pripremu radnog mjesta. Svijećenje je promatranje jaja naspram dovoljno svijetlog izvora svjetlosti (ovoskop), zbog čega se na neosvijetljenoj strani ljuske stvaraju sjene iz unutarnjih struktura (slika 16.). Svijeće se obavlja u zamračenoj prostoriji. Istovremeno, grafitnom olovkom na ljusci je označena granica zračne komore, mjesto embrija i područje avaskularne zone dimenzija 0,5x0,5 cm.Ove oznake služe kao smjernica pri odabiru mjesto za uvođenje materijala koji sadrži virus. Kod svijeće se također utvrđuje da li je embrij živ ili mrtav. Embriji koji pokazuju aktivne pokrete uz dobro punjenje CAO žila krvlju smatraju se živima.
Slika 16 - Svijećenje pilećeg embrija 10. dana inkubacije. Vidljive su sjene: 1 - embrij; 2 - žumanjčana vrećica; 3 - krvne žile CAO; 4 - zračna komora; 5 - protein
Pileći embriji se inficiraju u aseptičnim uvjetima (po mogućnosti u kutiji). U predboksu se ljuske zametaka tretiraju jodiranim alkoholom, zatim se više puta brišu u kutiji, a ponekad se i flambiraju - tretiraju se plamenom štapića navlaženog alkoholom.
Embriji se fiksiraju u posebne stalke smještene u emajliranu kivetu na 3-4-slojnu gazu navlaženu otopinom za dezinfekciju.
U radu se koriste instrumenti sterilizirani kuhanjem. Stavljaju se u staklenku alkohola i spaljuju plamenom plamenika prije svake ponovne upotrebe.
Demonstracija
a) klinički znakovi bolesti u zaraženih laboratorijskih životinja; b) metode ubijanja laboratorijskih životinja; c) tehnike obdukcije (skretanje pažnje učenika na stanje unutarnjih organa) i tehnike dobivanja materijala koji sadrži viruse; d) tehnike izrade moždanih otisaka; e) radnje dekontaminacije radnog mjesta i leša nakon otvaranja zaražene životinje.
Zadaci
1. Proučite građu pilećeg embrija.
2. Izvršite ovoskopiju pilećeg embrija, odredite njegovu održivost i označite granice sjena prirodnih formacija.
3. Pripremite pileće embrije za infekciju.
Samostalni rad učenika
a) prepoznavanje miševa zaraženih od strane svakog učenika po boji, analiza kliničkog stanja, ubijanje, fiksacija u kiveti s voštanim (parafinskim) dnom, obdukcija; b) analiza patoanatomskih promjena, dobivanje materijala koji sadrži virus (parenhimski organi), priprema sloj po sloj otisaka mozga.
Studenti provode ovoskopiju pilećeg embrija, utvrđuju njegovu održivost i označavaju granice sjena prirodnih formacija.
Sažimanje lekcije
Zadatak za sljedeću lekciju
Kontrolna pitanja
1. Građa pilećeg embrija.
2. Zašto se pileći embriji koriste u virologiji?
3. Kakva je građa pilećeg embrija u razvoju?
